Elucja gradientowa charakteryzuje się zmianami siły elucyjnej wynikającymi ze zmian składu fazy ruchomej w trakcie trwania procesu chromatograficznego. Przebieg zmian może być różny. Najczęściej przybiera kształt liniowy:

Gradient uzyskuje się poprzez dodawanie rozpuszczalnika B o większej sile elucyjnej (rozpuszczalnik organiczny), do rozpuszczalnika A o mniejszej sile elucyjnej (zwykle woda). W rezultacie, w trakcie procesu chromatograficznego następuje obniżanie się współczynnika retencji analitu. Taki efekt w RP HPLC w przypadku substancji jonogennych można uzyskać poprzez wytwarzanie gradientu pH fazy ruchomej, wywołując stopniowy wzrost stężenia formy zjonizowanej, o mniejszej retencji. Linową zmianę pH uzyskuje się w wyniku zaprogramowanego (zwykle liniowo) mieszania w odpowiednich proporcjach odpowiednich buforów.

Efektywne wykorzystanie gradientowej HPLC wymaga znajomości podstawowych czynników określających wytwarzany gradient oraz retencję analitu. Podstawowymi parametrami opisującymi gradient stężenia składnika B w eluencie są czas trwania gradientu (t_G) oraz rodzaj gradientu (liniowy, wklęsły, itp.). Zwykle stosowany jest gradient liniowy, który pozwala na względnie łatwe matematyczne opisanie retencji analitu. Na rysunku 2 przedstawione zostały zmiany składu fazy ruchomej wprowadzanej na kolumnę chromatograficzną w trakcie przebiegu procesu chromatograficznego. Start gradientu na kolumnie opóźniony jest o pewną stałą wartość td, zwaną czasem opóźnienia gradientu (dwell time). Wielkość ta jest związana z charakterystyczną dla urządzenia analitycznego objętością mieszalnika i przewodów łączących mieszalnik z dozownikiem próbek. Czas opóźnienia gradientu to czas potrzebny na dotarcie początku gradientu na wlot kolumny.

Fazę ruchomą traktuje się jako niezatrzymywaną na kolumnie. Przy tym założeniu czas przejścia początku gradientu przez kolumnę odpowiada czasowi martwemu t_o. Czas martwy określa różnicę powstającą między składem fazy na wejściu i wyjściu kolumny. W rzeczywistości zmiany składu fazy w kolumnie nie przedstawiają się prosto. Różnica między zaprogramowanym a realizowanym programem jest powodowana przede wszystkim nieidealnym mieszaniem się cieczy w elementach aparatu oraz opóźnieniem międzyfazowego transportu masy. Może to prowadzić do odchyleń od wyznaczonych teoretycznie czasów retencji analitów. Przy teoretycznym opisie liniowego gradientu zakłada się, że program pompy dokładnie przekłada się na zmiany składu fazy ruchomej w kolumnie oraz że nie następuje zatrzymywanie żadnego składnika eluentu w kolumnie. Parametry retencji analitu w elucji gradientowej oznaczane są takimi samymi symbolami, jak w warunkach izokratycznych, a mianowicie: czas retencji t_R, zredukowany czas retencji t’_R oraz współczynnik retencji k:

Jednakże w gradiencie symbole mają nieco inne znaczenie. W przypadku elucji izokratycznej, parametry określone powyższym równaniem są stałe dla danego związku w trakcie całego procesu analizy. W elucji gradientowej, wraz ze zmianą składu fazy ruchomej w czasie, następuje zmiana współczynnika retencji k_a, rozumianego jako izokratyczny współczynnik retencji k w danej chwili, tzn. odpowiadającego aktualnemu składowi fazy ruchomej w miejscu, gdzie znajduje się analit. W związku z tym, współczynnik retencji k wyznaczony w warunkach gradientowych nie przedstawia stosunku liczby moli analitu w fazie stacjonarnej i ruchomej, jak to było w warunkach izokratycznych. Współczynnik retencji gradientowej jest jakby wypadkową wszystkich chwilowych izokratycznych wartości współczynników retencji w trakcie trwania gradientu, których wartości warunkuje aktualny skład fazy ruchomej w miejscu, gdzie znajduje się analit.

Literatura

1. P. Wiczling, R. Kaliszan: Gradientowa RP HPLC , w: Nowoczesne techniki analityczne, pod red. M. Jarosza, Warszawa : Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej, 2006, s. 67-84.